Firmas de metaloenzimas en carbonatos autigénicos de las zonas fronterizas de Chukchi en el Océano Ártico occidental

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 16597 (2022) Citar este artículo

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La migración de fluidos ricos en metano en filtraciones frías submarinas impulsa una intensa actividad microbiana y la precipitación de carbonatos autigénicos. En este estudio, analizamos muestras de carbonato autigénico derivadas de microbios recientemente recuperadas de montículos de hidratos de gas activos en la ladera suroeste de Chukchi Borderlands (CB), en el oeste del Océano Ártico. Nuestro objetivo principal fue caracterizar los patrones de distribución de oligoelementos en fracciones lipídicas alojadas en carbonatos para evaluar los requisitos de metaloenzimas de los microbios involucrados en la oxidación anaeróbica del metano (OMA). Medimos isótopos estables, oligoelementos, biomarcadores lipídicos y ADN genómico, y los resultados indican el predominio de los biomarcadores lipídicos relacionados con la OMA en las muestras de carbonato estudiadas, así como una aparición predominante de arqueas metanotróficas anaeróbicas (ANME) -1. También reportamos evidencia de enriquecimientos preferenciales significativos de varios oligoelementos (Li, Ni, Co, Cu, Zn y Mo) en las fracciones de lípidos totales de los carbonatos de CB, en relación con las composiciones elementales determinadas para las fracciones de carbonato correspondientes, que difieren de las mencionadas anteriormente. reportado para otros sitios de filtración. Nuestra hipótesis es que los enriquecimientos de oligoelementos en fracciones de lípidos alojadas en carbonatos podrían variar según el tipo de ensamblaje microbiano de OMA. Se requiere trabajo adicional para investigar más a fondo los mecanismos de los oligoelementos unidos a lípidos en los carbonatos de filtración fría como posibles metaloenzimas en la OMA.

Las filtraciones frías ocurren en los márgenes de los océanos en todo el mundo1,2, correspondientes a emanaciones de fluidos ricos en metano desde el fondo marino hacia la columna de agua3,4. Las tasas de filtración de fluidos reducidos pueden variar sustancialmente en el fondo marino5, lo que genera un amplio espectro de condiciones redox en los sedimentos subterráneos en las filtraciones frías6. Un proceso biogeoquímico clave en las filtraciones submarinas de metano es la oxidación anaeróbica del metano (OMA), que consume eficientemente una fracción sustancial del metano liberado en la columna de agua suprayacente7,8. Durante la OMA, los niveles de alcalinidad aumentan fuertemente en las aguas de los poros circundantes debido a la producción de biocarbonato (HCO3-), lo que promueve la sobresaturación y precipitación de carbonatos2,9. En consecuencia, la precipitación de carbonatos autigénicos se encuentra típicamente en filtraciones frías10,11, lo que puede servir como archivo para investigar eventos de liberación de metano en filtraciones tanto modernas como antiguas12,13.

La OMA suele estar mediada por un consorcio de arqueas metanotróficas anaeróbicas (ANME) y bacterias reductoras de sulfato (SRB)14,15. Sin embargo, estudios recientes también han informado que los ANME también pueden utilizar otros aceptores de electrones, como los oxihidróxidos ricos en manganeso (Mn) y hierro (Fe), para promover la oxidación del metano en filtraciones frías16. En particular, otros metales traza como el níquel (Ni), el cobalto (Co), el molibdeno (Mo), el tungsteno (W) y el zinc (Zn) también pueden participar en la OMA, actuando como cofactores enzimáticos17,18. La mayoría de estos hallazgos se han obtenido de experimentos de cultivo17,19. Un estudio reciente caracterizó, por primera vez, la geoquímica de oligoelementos de las fracciones de lípidos totales conservadas en carbonatos autigénicos de varias filtraciones en todo el mundo, como los abanicos del Congo, las profundidades del Nilo y el Níger, y el Golfo de México20, lo que sugiere que Este enfoque podría utilizarse para identificar trazas de metales esenciales para la actividad microbiana en filtraciones frías. Un estudio anterior informó un marcado enriquecimiento de Ni, Co, Mo y W en fracciones lipídicas alojadas en carbonato, que estaban relacionadas con vías enzimáticas previamente identificadas involucradas en la OMA20. No obstante, la información sobre cómo la OMA puede verse influenciada por cambios en la biodisponibilidad de metales traza en filtraciones frías sigue siendo escasa.

Recientemente, se han descubierto estructuras de montículos de hidratos de gas en las zonas fronterizas de Chukchi (CB) en el Océano Ártico occidental21. La información geoquímica sobre el origen del gas emitido y las propiedades del fluido de los poros se obtuvo dentro de esta estructura de montículo durante la expedición R/V ARAON ARA09C en 201822. Sin embargo, hasta ahora, las firmas biogeoquímicas preservadas en carbonatos autigénicos no han sido investigadas en estos gases recién descubiertos. montículos de hidratación. En este estudio, proporcionamos una caracterización geoquímica detallada de una serie de muestras de carbonato autigénico utilizando mineralogía y isótopos estables de oxígeno y carbono, así como abundancias de oligoelementos, biomarcadores de lípidos y ácidos nucleicos. Los principales objetivos de este estudio fueron i) evaluar los factores ambientales clave que controlan la precipitación de carbonatos en los montículos de CB, ii) caracterizar las características geoquímicas y de la comunidad microbiana en los montículos de CB, y iii) evaluar la relación de los metales traza en la actividad microbiana asociada con la OMA comparando nuestros nuevos datos sobre firmas geoquímicas y microbianas de CB con los obtenidos previamente en otras filtraciones en todo el mundo20. Nuestro objetivo fue probar la hipótesis de que los enriquecimientos de oligoelementos específicos en las fracciones lipídicas totales extraídas de carbonatos autigénicos podrían ser indicativos de una utilización preferencial de oligoelementos por parte de diferentes comunidades ANME. Nuestro estudio arroja nueva luz sobre los requisitos de metaloenzimas de los microbios involucrados en la OMA.

Las muestras de carbonato autigénico recolectadas en este estudio (Fig. 1, ver también Fig. S1 en la Información complementaria) estuvieron dominadas por calcita, con una contribución menor de dolomita (Tabla 1). Los valores de δ13C de los carbonatos (δ13Ccarbonato) se agotaron, variando entre − 37,0 y − 32,8 ‰. Los valores de δ18O de los carbonatos (δ18Ocarbonato) oscilaron entre 3,9 y 5,6 ‰, y se produjeron valores más enriquecidos en muestras de las capas de sedimentos más profundas (Tabla 1). Los valores medidos de δ13Ccarbonato y δ18Ocarbonato de carbonatos de CB a granel se superpusieron parcialmente con los determinados para una serie de muestras de carbonato de filtración investigadas previamente20 (Tabla 1 y Fig. S210,23,24,25,26,27).

Mapa que muestra (a) las estructuras de montículos descubiertas en las tierras fronterizas de Chukchi (CB) con carbonatos autigénicos investigados en este estudio y (b) cuatro sitios de estudio de comparación: abanico del Congo (CF), abanico de aguas profundas del Nilo (NDSF), abanico de Níger ( NF) y Golfo de México (GoM). El mapa batimétrico se generó con la Carta Batimétrica Internacional del Océano Ártico Versión 3.0 (https://www.ngdc.noaa.gov/mgg/bathymetry/arctic). La imagen del perfil del subfondo (SBP) se adquirió utilizando un equipo SBP120 (frecuencia; 12 kHz, ángulo de haz amplio; 90–120 °, Kongsberg). El mapa oceánico global se generó con Ocean Data View versión 5.1.4 (GlobalHR, https://odv.awi.de).

Los datos de elementos traza para carbonato (lixiviados de AA 1 M), sulfuro (lixiviados de HNO3 3 M), silicato detrítico (digestión con HF-HCl) y fracciones de lípidos se informan en las Tablas S1 a S4 de la Información complementaria. En comparación con JLs-1 (material de referencia de carbonato; piedra caliza del Triásico), las fracciones de carbonato investigadas en este estudio se caracterizaron generalmente por abundancias de elementos traza mucho mayores (Fig. 2 y Fig. S3), muchos de los cuales (litio (Li), transición (metales como estroncio (Sr), REE, plomo (Pb) y torio (Th)) se enriquecieron hasta unos cientos de veces. Por el contrario, tres elementos (titanio (Ti), bario (Ba) y W) mostraron concentraciones relativamente más bajas (hasta diez veces más en comparación con JLs-1).

Factores de enriquecimiento de (a) datos de la fracción de carbonato (lixiviados de AA 1 M) normalizados a los valores del material de referencia de carbonato JLs-1, (b) datos de la fracción lipídica total normalizados a los valores del material de referencia de carbonato JLs-1, y (c) datos de la fracción de lípidos totales normalizados a los valores de las fracciones de carbonato correspondientes (lixiviados de AA 1 M).

Los datos de elementos traza para las fases sólidas ricas en sulfuro extraídas (es decir, lixiviados de HNO3 3 M) se normalizaron con los datos de las fracciones de carbonato correspondientes, lo que indica que algunos elementos (Ti, cobre (Cu), circonio (Zr) y Th) en las fracciones de carbonato y sulfuro se enriquecieron entre 10 y 100 veces (Fig. S3). Las abundancias de oligoelementos en las fracciones de silicato detrítico también se normalizaron con los valores de referencia del Post Archean Australian Shale (PAAS)28. Algunos elementos, como Li, Rb (rubidio), Ba, W, Pb, Th y U, estaban relativamente enriquecidos en las fracciones de silicato detrítico en relación con PAAS (Fig. S3). Para las fracciones de lípidos, varios oligoelementos mostraron una amplia gama de valores de abundancia (Li: 2,8–29,9 ppm, metales de transición: 0,5–300 ppm, Rb: 2,2–4,1 ppm, Sr: 12,0–45,0 ppm, Ba: 13,0–22,0 ppm, tablas S1 a S4). Por el contrario, los REE mostraron abundancias muy bajas (<1,34 ppm) en las fracciones de lípidos. En particular, los datos de la fracción de lípidos normalizados a JLs-1 y las fracciones de carbonato de los carbonatos CB mostraron claramente un marcado enriquecimiento de Ti, Ni, Cu, Zn y Pb (hasta 10 a 1000 veces; Fig. 2, ver también Fig. .S4).

Las concentraciones de lípidos bacterianos y arqueales mostraron grandes variaciones en los carbonatos autigénicos CB (Fig. 3, ver también Tabla S5). Entre los hidrocarburos isoprenoides, los isoprenoides irregulares de cola con cola, como el crocetano, a menudo coeluyen con fitano. Teniendo en cuenta que las composiciones isotópicas de los picos de crocetano/fitano en los carbonatos de CB estaban entre -28,5 y -25,4‰ (Tabla S5), es decir, sin agotamiento de 13C, parece que el crocetano estuvo casi ausente en nuestras muestras, pero el fitano derivado del La degradación de la clorofila y otros pigmentos estuvo presente con valores de 0,01 a 0,05 μg g − 1 de peso seco (ps). El compuesto C25 2,6,10,15,19-pentametilicosano (PMI) se detectó en el rango de 0,02 a 0,04 μg g- 1 dw. Además, las diéteres de dialquilglicerol isoprenoide (DGD isoprenoide), como el arqueol y el sn-2-hidroxiarqueol, fueron los lípidos de arquea más predominantes en las muestras, mostrando rangos de concentración de 0,02 a 0,18 μg g − 1 dw y 0,02 a 0,32 μg g − 1 dw, respectivamente. Para los lípidos bacterianos, se identificaron DGD no isoprenoides (es decir, If, IIa y IId) con restos anteisopentadecilo o grupos ciclopropilo unidos en las posiciones sn-1 y sn-2, con un rango entre 0,01 y 0,11 μg g- 1 dw. . Con respecto a otros DGD (series I, II y III), no pudimos determinar completamente su presencia debido al límite de detección. Entre los ácidos grasos (AG) detectados, los AG saturados (p. ej., C16:0 y C18:0) fueron los más predominantes, con un rango entre 0,04 y 0,62 μg g- 1 dw (Tabla S5). Otros AG (p. ej., i-C15:0, ai-C15:0, C16:1ω7, C18:1ω9, C18:1ω7, C20:0 y C22:0) tenían una concentración aproximadamente de 2 a 10 veces menor (0,01– 0,23 μg g − 1 dw) en comparación con los AG saturados predominantes (Tabla S5). Los valores de δ13C del PMI oscilaron entre −88,2 y −61,5‰ (Fig. 3, ver también Tabla S5). Los valores de δ13C de arqueol y sn-2-hidroxiarqueol variaron entre - 102,9 y - 82,9 ‰ y entre - 108,0 y - 87,5 ‰, respectivamente (Fig. 3, consulte también la Tabla S5). Finalmente, los valores de δ13C de los DGD no isoprenoides oscilaron entre -88,6 y -50,6‰ (Fig. 3, consulte también la Tabla S5).

Firmas de biomarcadores lipídicos de carbonatos autigénicos del CB: (a) concentraciones de los principales biomarcadores lipídicos y proporciones de sn-2-hidroxiarqueol en relación con el arqueol, y (b) composiciones isotópicas de carbono de los principales biomarcadores lipídicos. Tenga en cuenta que la línea discontinua indica el valor promedio de δ13C de metano (δ13CCH4), mientras que el área sombreada muestra el rango completo de valores de δ13CCH4.

Los filos de arqueas detectados en las muestras estudiadas fueron Euryarchaeota, Lokiarchaeota, Bathyarchaeota y Thaumarchaeota (Tabla S6), siendo Euryarchaeota la que tuvo la mayor abundancia, representando > 85% del total de secuencias de arqueas. Entre ellos, la abundancia relativa de arqueas ASV032, que pertenece a ANME-1, fue dominante (hasta 99,5%; Fig. 4). Otra arquea, ASV095, que pertenece a Methanosarcinales, comprendió entre el 0,5% y el 64,4% de las secuencias de arqueas. En las comunidades bacterianas, predominaron Firmicutes, Proteobacteria, Atribacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Planctomycetes y WM88 (Tabla S6).

Abundancias relativas de taxones de arqueas a nivel de filo y orden de Euryarchaeota en carbonatos autigénicos de la zona fronteriza de Chukchi (CB). 'nd' denota 'no determinado'.

La calcita de magnesio (Mg) fue el mineral más dominante (23–46% en peso) en todas las muestras de carbonato recuperadas de los montículos de CB (Tabla 1). Generalmente, las condiciones ambientales durante las cuales se produce la precipitación de carbonatos en las filtraciones frías se pueden inferir de la composición mineralógica de los carbonatos23,29. Por ejemplo, se cree que la precipitación de aragonito se ve favorecida en condiciones subóxicas caracterizadas por altas concentraciones de sulfato disuelto en las aguas de los poros (es decir, cerca del fondo marino), mientras que la calcita y la dolomita con alto contenido de Mg se forman preferentemente en condiciones más reductoras y niveles bajos de sulfato30. Los minerales de carbonato que contienen magnesio, como la dolomita, se encuentran a menudo en capas de sedimentos empobrecidas en sulfato relativamente enterradas a gran profundidad31. Por analogía, los carbonatos de calcita y magnesio encontrados en los montículos de CB probablemente indican precipitación en condiciones reductoras dentro de la columna de sedimento32. Además, considerando que el sulfuro disuelto puede catalizar la deshidratación de los iones Mg2+ en los fluidos, permitiendo una precipitación más rápida de las calcitas de Mg en comparación con la aragonita33, los montículos de CB pueden estar sujetos a condiciones anóxicas durante largos períodos de tiempo, ya que los microambientes enriquecidos con sulfuro podrían tener sido moldeado por procesos de OMA en condiciones anóxicas. Además, la precipitación preferencial de calcita sobre aragonita puede ocurrir a temperaturas relativamente bajas34, dado que la temperatura en las aguas marinas del fondo del mar de Chukchi suele ser inferior a 1 °C21. Por lo tanto, estas propiedades podrían explicar potencialmente el predominio de la calcita sobre la aragonita en las muestras de carbonato.

Los valores medidos de δ13Ccarb (- 37,0 a - 32,8 ‰; Tabla 1 y Fig. S2) fueron significativamente más bajos que los valores típicos (~ 0 ‰) del bicarbonato marino (es decir, carbono inorgánico disuelto en agua de mar)35. En general, los valores de δ13Ccarb reflejan la fuente de carbono disuelto incorporado durante la precipitación de carbonatos36. Las contribuciones potenciales de estas diferentes firmas isotópicas de carbono incluyen (1) metano (δ13CCH4 para origen biogénico; < -60 ‰, y δ13CCH4 para origen termogénico; − 50 a − 30 ‰) y (2) materia orgánica (ca. − 25 ‰ )37,38. Además, el grado de agotamiento del 13C en los carbonatos puede ser un indicador de procesos microbianos específicos39,40. Teniendo en cuenta que la composición isotópica de carbono del metano ascendente (δ13CCH4; − 95,7 a − 44,1 ‰) investigada en los montículos CB refleja una mezcla de fuentes biogénicas y termogénicas22, la oxidación microbiana que utiliza este metano ascendente puede producir bicarbonato empobrecido en 13C (HCO3−). en sedimentos. No pudimos determinar la edad precisa de las muestras de carbonato utilizando el método U-Th, debido a las grandes cantidades de Th detrítico en nuestras muestras. No obstante, considerando las profundidades de muestreo de nuestras muestras de carbonato (ver Fig. S1), podrían estar débilmente relacionadas con la actual zona de transición sulfato-metano (SMTZ). Por lo tanto, el agotamiento isotópico de todos los carbonatos (δ13Ccarb < − 30‰) en los montículos CB sugiere que una fracción sustancial del carbono involucrado en la precipitación de carbonatos se derivó de los fluidos ascendentes ricos en metano, probablemente relacionados con liberaciones antiguas de metano similares a las ocurrido en el mar de Barents41. Los fluidos de los poros se enriquecen con 18O (δ18Ofluid) durante la deshidratación del mineral arcilloso o la disociación de hidratos de gas, lo que resulta en valores altos de δ18Ocarb30,42,43. En el sitio estudiado, se han identificado capas de hidratos de gas a profundidades de sedimento inferiores a 3-4 m22. En este sentido, los carbonatos dominados por calcita (δ18Ocarb; 5,1 ± 0,6‰ VPDB (n = 7), Tabla 1 y Fig. S2) investigados en los montículos de CB muestran firmas isotópicas enriquecidas en 18O. Por lo tanto, estos resultados pueden indicar que precipitaron a partir de aguas de poros enriquecidas de manera similar, como resultado de la disociación de hidratos de gas.

En comparación con los carbonatos bioesqueléticos marinos (es decir, piedra caliza JLs-1), la mayoría de los oligoelementos en las fracciones de carbonato se enriquecen en los carbonatos de filtración fría estudiados, excepto Ti, Ba y W (Fig. 2a). Se explica bien que estos enriquecimientos reflejan la composición geoquímica de las aguas de los poros circundantes, heredada de varios procesos diagenéticos tempranos que generalmente resultan en un enriquecimiento selectivo de oligoelementos44. En las filtraciones frías, los carbonatos autigénicos dominados por la calcita suelen incorporar mayores cantidades de oligoelementos (incluidos los REE) en comparación con las muestras ricas en aragonito, que se forman cerca del fondo marino27. Además, las condiciones anóxicas sostenidas en las filtraciones frías generalmente explican por qué muchos oligoelementos sensibles al redox (Mo, U, Ni, V, Co y Zn) están enriquecidos en los correspondientes carbonatos autigénicos, como en las muestras de carbonato CB45. El enriquecimiento de Mo generalmente se relaciona con el ciclo de oxihidróxido de Fe-Mn en sedimentos subterráneos y/o la formación de minerales de sulfuro, como resultado de la presencia de sulfuro de hidrógeno en las aguas intersticiales liberadas por AOM46. De manera similar, los enriquecimientos observados identificados para Ni, Co y Zn reflejan la remineralización de la materia orgánica en los sedimentos subterráneos, lo que también resulta en aguas de poros sedimentarias enriquecidas47,48.

Los extractos lipídicos totales de carbonatos de CB mostraron enriquecimientos particulares de oligoelementos (Li, Ti, Ni, Co, Cu, Zn y Mo) en comparación con las fracciones de carbonato correspondientes (Fig. 2c). A diferencia de los enriquecimientos observados en las fracciones de carbonatos lixiviados, que se heredan directamente de la composición química de las aguas intersticiales de las que han precipitado, el enriquecimiento asociado con las fracciones lipídicas alojadas en carbonatos autigénicos puede proporcionar información sobre los elementos bioesenciales relacionados. a la actividad microbiana impulsada por la OMA en las filtraciones20. Hasta ahora, se han identificado Ni y Zn en células de organismos microbianos, especialmente en conjuntos microbianos relacionados con filtraciones, donde están unidos a sitios específicos de proteínas y enzimas49,50. Co está presente en cobamidas involucradas en la transferencia de grupos metilo durante la metanogénesis y los procesos metanotróficos17. El Mo está unido a un cofactor de pterina para formar molibdopterina, que cataliza reacciones redox de electrones50, mientras que el Zn se presenta como un único átomo estructural en ambas enzimas50 (p. ej., enzima metanol-coenzima M metiltransferasa (Mta) y heterodisulfuro reductasa (Hdr)). Teniendo en cuenta que las metaloenzimas microbianas desempeñan un papel clave en la catalización de reacciones biogeoquímicas importantes, en particular AOM51, estas enzimas pueden requerir algunos elementos traza (p. ej., Co, Ni, Mo y Zn) como cofactores para el transporte de electrones o como centros catalíticos en niveles activos. sitios50. Aunque los oligoelementos (especialmente Cu y Ni) pueden enriquecerse en las fracciones orgánicas (es decir, lipídicas) debido a sus afinidades quimiofísicas con la materia orgánica45, los oligoelementos, como Co, Ni, Mo y Zn, se enriquecieron, no sólo en las fracciones de lípidos (Fig. 2b) pero también en las fracciones de carbonato (Fig. 2a). Por lo tanto, es más probable que el enriquecimiento de Co, Ni, Mo y Zn identificado en las fracciones lipídicas totales asociadas con los carbonatos de CB refleje su implicación en vías enzimáticas específicas ricas en metales relacionadas con la actividad metanotrófica impulsada por la OMA. El Fe está presente principalmente como grupos de Fe-S utilizados para el transporte de electrones y/o catálisis, mientras que el Ni está unido a grupos de Fe-S o en el centro de una porfirina exclusiva de los metanógenos/metanótrofos que contienen el cofactor F43052. Por lo tanto, su enriquecimiento en los extractos de lípidos totales separados de los carbonatos de CB podría reflejar de manera similar su papel potencial como factor limitante para las actividades metanotróficas debido a su alta biodisponibilidad como metaloenzimas esenciales durante la OMA53.

En cuanto al Cu, que también se enriqueció significativamente en las fracciones lipídicas analizadas, cabe mencionar que aún no se han identificado enzimas metanotróficas anaeróbicas dependientes de Cu, aunque la disponibilidad de Cu es importante para los metanótrofos aeróbicos54. Por ejemplo, un aumento en la concentración de Cu puede causar una expresión de hasta 55 veces de metano monooxigenasa particulada (pMMO) como una proteína de membrana que se encuentra en los metanótrofos aeróbicos50. Recientemente se han documentado enriquecimientos similares en filtraciones frías para elementos ligeros de tierras raras (p. ej., La, Ce), lo que también refleja su utilidad preferencial en la actividad metanótrofa aeróbica55. En los carbonatos de CB, las fracciones de lípidos totales extraídas no mostraron ningún enriquecimiento particular en REE ligero, lo que indica un desacoplamiento entre Cu y REE ligero. Dado que los carbonatos de Mg-calcita precipitaron predominantemente en condiciones anóxicas en los montículos de CB, los enriquecimientos de Cu observados en los carbonatos de CB no estarían asociados con la metanotrofia aeróbica. Por lo tanto, se requieren estudios adicionales para evaluar mejor la utilidad potencial del Cu en el tratamiento de la OMA. De manera similar, aún es necesario dilucidar por qué Li y Ti se enriquecieron en las fracciones lipídicas estudiadas en los carbonatos de CB, y si la biodisponibilidad potencial de Li y Ti como metaloenzimas podría representar un factor limitante en la metanogénesis y la actividad metanotrófica en condiciones anóxicas. En particular, estos elementos se han identificado previamente en células de microorganismos, especialmente en conjuntos microbianos relacionados con filtraciones, donde se sabía que estaban unidos a sitios específicos de proteínas y enzimas49,50. Por lo tanto, hasta cierto punto, especulamos que los enriquecimientos observados en Cu, Li y Ti en los lípidos totales de los carbonatos de CB podrían ser indicativos de procesos microbianos alternativos para la OMA como metaloenzimas. Por lo tanto, en muchos aspectos fisiológicos y biogeoquímicos, se requieren más investigaciones para investigar la disponibilidad potencial de Cu, Li y Ti en metanógenos/metanótrofos anaeróbicos en cultivos puros.

En este estudio, los hidrocarburos irregulares (p. ej., PMI) y los DGD isoprenoides (p. ej., arqueol y sn-2-hidroxiarqueol) se identificaron como lípidos relacionados con la OMA, lo que muestra el predominio de los DGD isoprenoides en la mayoría de las muestras de carbonato de CB (Fig. 3). La composición de δ13C de estos lípidos indicó firmas relativamente agotadas en 13C, en comparación con las reportadas para el metano en los montículos de CB (Fig. 3). En general, los lípidos microbianos derivados del metano se agotan en 13C en comparación con la fuente de metano como resultado del fraccionamiento isotópico durante la asimilación del metano56. Los DGD isoprenoides más empobrecidos en 13C (es decir, arqueol y sn-2-hidroxiarqueol) pueden indicar la aparición de metanótrofos involucrados en la OMA. En particular, CB-6 mostró los DGD isoprenoides empobrecidos en 13C más predominantes. Este patrón de agotamiento de 13C podría estar estrechamente relacionado con la OMA activa que tiene lugar en las capas de sedimentos donde se encuentra actualmente la SMTZ22 (profundidad de sedimento de 90 a 120 cm). Por otro lado, debido a que la profundidad de la SMTZ en las filtraciones de metano puede fluctuar como resultado de los flujos ascendentes de metano57,58, las bajas cantidades de lípidos empobrecidos en 13C investigadas en otras muestras de carbonato CB podrían explicarse alternativamente como resultado de la difusión. migración de fluidos ricos en metano59. En este contexto, la baja cantidad de lípidos microbianos empobrecidos en 13C en los carbonatos de CB por debajo y por encima de la SMTZ actual puede reflejar potencialmente las débiles actividades de la OMA como firma fósil durante el cambio en los flujos de metano60. También se detectaron DGD no isoprenoides (If, IIa y IId) derivados de SRB termófilos y halófilos61,62 en los carbonatos de CB estudiados (Fig. 3). En general, la abundancia de lípidos bacterianos en los carbonatos de CB fue menor que la de los lípidos de arqueas relacionados con la OMA. Teniendo en cuenta estudios previos en otras filtraciones frías, como el Mar del Norte63 y el Mar Mediterráneo Oriental64, el patrón observado entre ambos grupos de lípidos parece reflejar el proceso de reducción de sulfato acoplado a OMA. Además, estos lípidos bacterianos están más enriquecidos en 13C en comparación con los lípidos de arqueas (∆13C = 10–15‰), lo que refleja su participación en la OMA como socios sintróficos7,65. Con base en estos fraccionamientos isotópicos, los DGD no isoprenoides empobrecidos en 13C en los carbonatos de CB (CB-1, -2, -6 y -7) pueden servir como evidencia de organismos sintróficos involucrados en la OMA. Sin embargo, los valores de δ13C de los DGD no isoprenoides (− 53,9 ± 3,6‰, n = 5) en otros carbonatos de CB (CB-3, -4 y -5) se enriquecieron ligeramente en 13C en relación con el metano ascendente informado en los montículos CB. Por lo tanto, estos lípidos enriquecidos en 13C pueden indicar que estos compuestos se originan a partir de una fuente mixta que media en la OMA y en otros procesos. Nuestros resultados deben confirmarse aún más mediante la determinación de las propiedades cuantitativas y cualitativas de los organismos fuente obtenidos a partir de diferentes enfoques analíticos, como la hidrólisis del hidróxido de potasio (KOH).

Sobre la base de los lípidos y ácidos nucleicos microbianos, se puede determinar la quimiotaxonomía de los microbios clave implicados en la OMA66. A menudo se han informado tres grupos de ANME (ANME-1, ANME-2 y ANME-3) en varios ambientes de filtración fría, que están relacionados con metanógenos del orden Methanosarcinales y Methanomicrobianos58,67. Las comunidades microbianas dominadas por ANME-1 biosintetizan arqueol y PMI con cantidades relativamente bajas de pentametilicosenos (PME), mientras que ANME-2 se caracteriza por el predominio de sn-2-hidroxiarqueol (en relación con el arqueol) y abundantes PME y crocetano/crocetenos66. Junto con la presencia de PMI en los carbonatos de CB, la proporción de sn-2-hidroxiarqueol a arqueol varió dentro del rango de 0,9 a 1,8 (Fig. 3), lo que sugiere la aparición dominante de ANME-1, que vivía en condiciones anaeróbicas de agotamiento de sulfato68 . Estos patrones lipídicos distintivos en la mayoría de los carbonatos de CB también fueron respaldados por proporciones más altas de ASV032, que pertenece a ANME-1 (Fig. 4). Además, la coexistencia de bacterias sintróficas asociadas con ANME-1 se puede inferir indirectamente de la abundancia de lípidos bacterianos, como los DGD no isoprenoides y los ácidos grasos66. Hasta la fecha, los DGD no isoprenoides empobrecidos en 13C se han encontrado principalmente en sistemas ANME-1 destacados66. Por lo tanto, los DGD no isoprenoides con menos agotamiento de 13C en los carbonatos de CB parecen estar asociados con un SRB desconocido vinculado a AOM69. Además, la baja abundancia de ácidos grasos ramificados (es decir, i-C15:0 y ai-C15:0) en los carbonatos de CB también puede indicar una presencia insignificante de SRB típicos (es decir, Desulfosarcina/Desulfococcus) asociados con ANME-1. Esta inferencia puede estar parcialmente respaldada por la secuencia incompleta de Deltaproteobacteria. Por lo tanto, estas características de los lípidos en los carbonatos de CB, en combinación con los datos de pirosecuenciación del gen 16S rRNA, sugieren que los SRB, que no pertenecen a Deltaproteobacteria pero posiblemente a otras comunidades bacterianas, habrían estado involucrados en la OMA en los montículos de CB. En particular, se ha demostrado microscópicamente que ANME-1 se presenta como una sola célula en ambientes de filtración fríos70. En consecuencia, las relaciones sintróficas relacionadas con ANME-1 dentro de los montículos CB parecen estar más vinculadas a otras comunidades bacterianas que los consorcios SRB típicos.

Para investigar más a fondo los patrones de distribución de elementos traza (W, Li, Ti, Ni, Co, Cu, Zn y Mo) que presumiblemente actúan como metaloenzimas potenciales involucradas en la OMA en filtraciones frías, se realizó un análisis de componentes principales (PCA) utilizando los datos. para extractos de lípidos totales normalizados a JLs-1 (Fig. 5a). Utilizamos estos datos para comparar muestras de carbonato autigénico recolectadas de diferentes regiones del mundo en lugar de aquellas normalizadas a fracciones de carbonato asociadas (Fig. S5). Aunque no se detectó W en nuestras muestras de lípidos totales del CB, este elemento se incluye porque se reportan anomalías pronunciadas de W unido a lípidos en otros sitios de filtración en todo el mundo20. La PCA también se realizó utilizando los datos de lípidos bacterianos y arqueales para comparar las firmas de CB con las de otras filtraciones frías (Fig. 5b-c). Los resultados del PCA muestran que la distribución combinada de oligoelementos y lípidos bacterianos en los carbonatos de CB difiere de los reportados para otras filtraciones de metano en todo el mundo (por ejemplo, abanico del Congo; CF, abanico de aguas profundas del Nilo; NDSF, abanico de Níger; NF y Golfo de México; Gobierno de México). Este hallazgo sugiere que el enriquecimiento de Ni, Co, Zn, Cu, Ti y Mo en fracciones lipídicas alojadas en carbonatos podría estar potencialmente relacionado con diferentes comunidades metanotróficas y sus metaloenzimas. Esta hipótesis es plausible porque ANME-1 predomina en los carbonatos de CB, mientras que ANME-1 y Methanosarcinales (potencial ANME-2) coexisten en otros sitios20 (Figs. 6, 7). La metil-coenzima MCR que contiene Ni es la enzima clave en AOM19. Se han aislado dos homólogos de MCR diferentes, denominados proteínas I y II71,72 de áreas de filtración fría: la proteína I contiene (172S)-172-metiltio-F430, mientras que la proteína II contiene F43018,73. Teniendo en cuenta que la proteína I se detecta predominantemente en ANME-174, podemos inferir que las condiciones ambientales particulares (por ejemplo, temperatura y presión parcial de metano) en el área del montículo CB promueven específicamente la síntesis de proteína I para AOM75 en comparación con lo que se puede observar en otros sitios de filtración. Se necesitan estudios futuros dirigidos a fuentes profundas de gas y fluido y a la litología del subsuelo para desentrañar los factores cruciales para determinar las actividades discriminativas de ANME involucradas en la respuesta estimulada bajo la disociación del permafrost. El impacto de la degradación de lípidos/enzimas en las correlaciones entre los lípidos y oligoelementos relacionados con la OMA también debe probarse comparando sus relaciones utilizando datos de muestras de carbonatos modernas y antiguas. Estudios anteriores han demostrado que existe una diferencia significativa en el enriquecimiento de oligoelementos entre las extracciones de lípidos intra e intercristalinos en carbonatos de filtración48. Por lo tanto, estudios futuros también deberían explorar el efecto del procedimiento de extracción en dos pasos sobre la distribución de oligoelementos.

Resultados de PCA para (a) los datos de metales traza para los lípidos totales normalizados a los valores del material de referencia de carbonato JLs-1, y para los datos de concentración de (b) lípidos de arqueas y (c) lípidos bacterianos.

Comparación de firmas de biomarcadores lipídicos de carbonatos autigénicos de CB, abanico del Congo (CF), abanico de aguas profundas del Nilo (NDSF), abanico de Níger (NF) y golfo de México (GoM): (a) concentraciones de los principales biomarcadores lipídicos y proporciones de sn-2-hidroxiarqueol en relación con arqueol, y (b) composiciones isotópicas de carbono de los principales biomarcadores lipídicos con los de carbonatos.

Árbol filogenético de secuencias de ADNr de arqueas obtenidas de carbonatos autigénicos.

Analizamos una serie de muestras de carbonato autigénico recolectadas en filtraciones de metano de la vertiente suroeste del CB utilizando varios sustitutos inorgánicos y orgánicos de fuentes fluidas y procesos biogeoquímicos (isótopos estables, mineralogía, oligoelementos, biomarcadores lipídicos y ácidos nucleicos). La ausencia de crocetano, la abundancia de PMI y la proporción relativamente baja de sn-2-hidroxiarqueol a arqueol en los carbonatos de CB indicaron la aparición dominante de ANME-1, como lo confirma la pirosecuenciación del gen 16S rRNA. Elementos traza específicos (Ni, Co, Zn, Cu, Ti y Mo) parecían estar enriquecidos en las fracciones lipídicas totales extraídas de los carbonatos de CB, lo que confirma hallazgos recientes de su utilidad como metaloenzimas en procesos microbianos relacionados con la OMA en filtraciones frías. Los patrones de enriquecimiento de oligoelementos y conjuntos de lípidos microbianos en los carbonatos de CB revelan características específicas distintas en comparación con las de otras filtraciones en todo el mundo (por ejemplo, abanico del Congo, abanico de aguas profundas del Nilo, abanico de Níger y Golfo de México). Este hallazgo sugiere que el enriquecimiento de oligoelementos en fracciones de lípidos alojadas en carbonato en filtraciones frías podría variar dependiendo del tipo de conjuntos microbianos de OMA entre los grupos ANME. Se requiere trabajo adicional para dilucidar el papel de los oligoelementos, como Co, Zn, Cu, Ti y Mo, como metaloenzimas potenciales en la OMA durante la fijación de N2 o la oxidación aeróbica de metano junto con la desnitrificación. En este sentido, son necesarios experimentos de cultivo puro para comprender su biodisponibilidad de las metaloenzimas involucradas en la OMA.

Estudios geofísicos previos (por ejemplo, perfiles multihaz y sub-fondo) realizados en la ladera suroeste del CB21 condujeron al descubrimiento de estructuras de montículos de hidratos de gas caracterizadas por supresión acústica debajo de la cresta a ciertos intervalos de profundidad (Fig. 1). Durante la expedición ARA09C en 2018, se recuperaron núcleos de sedimentos (ARA09C-ST07, -ST14 y -ST04/06) de tres estructuras de montículos, junto con varias muestras de carbonato autigénico recuperadas a diferentes profundidades de sedimento entre 38 y 415 cm (Fig. 1). ). Las muestras de carbonato recuperadas se limpiaron con agua ultrapura Milli-Q (MQ) y se secaron al aire antes de triturarlas hasta convertirlas en polvo utilizando un ágata y un mortero.

Las muestras a granel de carbonato autigénico se molieron hasta obtener un polvo fino (tamaño de partícula < 20 µm) para el análisis de minerales utilizando un sistema de difracción de rayos X (DRX) de Philips en los laboratorios del grupo de investigación de Cristalografía (Laboratorio Central de Cristalografía y Ciencias de los Materiales Aplicados, Universidad de Bremen). La fuente de rayos X fue un ánodo de Cu operado a 40 kV y 45 mA utilizando radiación CuKα equipado con un monocromador de grafito de haz difractado. Los escaneos por pasos se realizaron de 5 a 65° (2θ) con un tamaño de paso de 0,02° y un tiempo de conteo de 2 s por paso (0,6°/min). La identificación de minerales se realizó utilizando el software Philips X' Pert HighScore, que proporciona un valor semicuantitativo para cada mineral identificado sobre la base de valores de relación de intensidad relativa. Las composiciones isotópicas de oxígeno y carbono (δ18O y δ13C) de las muestras de carbonato se midieron en Beta Analytic (número de muestra de servicio: 536510 a 536,516). En resumen, la muestra se colocó en un vial limpio y se disolvió en H3PO4 para liberar CO2 en el espacio de cabeza del vial. La muestra se colocó en una bandeja con temperatura controlada (72 °C), donde se equilibró el CO2 durante una hora. Finalmente, se añadió helio (He) a la muestra y se inyectó una mezcla de He y CO2 en un espectrómetro de masas Finnegan MAT 251. Todos los valores isotópicos se expresaron utilizando la notación δ relativa al estándar Vienna Pee Dee Belemnite (VPDB) y se informaron en por mil (‰) con una desviación estándar de menos de 0,3 ‰ para los valores de δ18O y δ13C.

Se trataron muestras de carbonato homogeneizadas (~ 5 g) utilizando el procedimiento de extracción secuencial descrito anteriormente20 para separar selectivamente las fracciones de carbonato, sulfuro y silicato detrítico. Utilizamos las fracciones de lípidos obtenidas del método de extracción con solventes usando una mezcla de solventes orgánicos (diclorometano (DCM):metanol (MeOH), 2:1 v/v) para comparar oligoelementos en fracciones de lípidos con datos de biomarcadores de lípidos. Los extractos de lípidos totales (TLE) se dividieron en dos alícuotas para el análisis de oligoelementos en IFREMER (Institut Français de Recherche pour l'Exploitation de la Mer; es decir, "Instituto Francés de Investigación para la Explotación del Mar") y el análisis de biomarcadores lipídicos en el Instituto de Investigaciones Polares de Corea (KOPRI). Todos los análisis se realizaron utilizando un espectrómetro de masas de plasma acoplado inductivamente (ICP-MS) Element XR ™ en el Pôle Spectrométrie Océan (Brest, Francia). Las interferencias de óxidos e hidróxidos poliatómicos en el elemento de tierras raras (REE) se corrigieron utilizando tasas de formación de óxido determinadas analizando soluciones de MQ–H2O, Ba + Ce, Pr + Nd y Sm + Tb al comienzo de cada sesión de medición y aplicadas a todas las muestras. Las concentraciones elementales se calcularon utilizando el método de adición de Tm76,77. La precisión interna de todas las mediciones fue generalmente superior al 5%. También se realizaron análisis repetidos del material de referencia JLs-1 (piedra caliza del Triásico), con una precisión de <10% para la mayoría de los elementos traza, excepto Li (11,8% de desviación estándar relativa; RSD), Ti (61% RSD) y Zr (17% RSD). Tenga en cuenta que la RSD relativamente pobre determinada para Ti refleja principalmente la muy baja abundancia de este elemento en JLs-1 (4,1 µg/g). Se midieron enriquecimientos significativos de Ti en las fracciones de lípidos, hasta tres órdenes de magnitud (Tablas complementarias); por lo tanto, mucho más alto que el RSD determinado para JLs-1. Por lo tanto, estamos seguros de que los enriquecimientos de Ti medidos en los extractos de lípidos estudiados son significativos y, por lo tanto, los datos de Ti todavía se informan en este estudio. Debido a las altas proporciones Ba/REE, varias muestras de carbonato analizadas (incluido el material de referencia de carbonato JLs-1) mostraron concentraciones anormalmente altas de Eu (y en menor medida de Gd) como resultado de interferencias subcorregidas; por lo tanto, estos dos elementos no fueron reportados aquí.

Anteriormente se describieron procedimientos detallados para el análisis de biomarcadores lipídicos60. En resumen, la mitad del TLE se secó sobre Na2SO4 anhidro y se trató con reactivo de sulfito de tetrabutilamonio para eliminar el azufre elemental. El TLE se separó cromatográficamente en fracciones apolares y polares sobre una columna de Al2O3 (activada durante 2 h a 150 °C). La fracción apolar se eluyó usando hexano:DCM (9:1) y se agregaron 40 µL de 5α-androstano (10 µg mL-1) como estándar interno. La fracción polar se recuperó con DCM:MeOH (1:1 v/v) como eluyente y se dividió en dos alícuotas, a las que se añadió 7,16-diol C22 (10 µg ml- 1) o ácido nonadecanoico C19 (10 µg ml-1). − 1) se añadió como estándar interno. Cada alícuota se derivatizó mediante sililación y metilación, antes de la cuantificación mediante cromatografía de gases (GC) y la identificación mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). Las condiciones de GC y GC-MS fueron las descritas anteriormente60. Los compuestos moleculares se determinaron comparando sus patrones de fragmentación espectral de masas y tiempos de retención con datos publicados previamente60. Los valores de δ13C de los compuestos lipídicos se determinaron utilizando un espectrómetro de masas de relación isotópica (IRMS) conectado a un GC a través de una interfaz de combustión (tubo de vidrio lleno de óxido de cobre, CuO, operado a 850 °C), como se describió anteriormente60. Los valores isotópicos se expresaron como valores de δ13C por mil en relación con VPDB. Los valores de δ13C se corrigieron para la introducción de átomos de carbono adicionales durante la sililación y la metilación. Los errores analíticos fueron inferiores a ± 0,4 ‰ para todos los compuestos lipídicos.

El ADN genómico se extrajo utilizando el kit FastDNA Spin para suelos (MP Biomedicals, EE. UU.). Las muestras de ADN se sometieron a amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), preparación de bibliotecas y secuenciación Illumina MiSeq de extremos emparejados (2 × 300 pb) en Integrated Microbiome Resource (IMR), Universidad de Dalhousie, Canadá (http://cgeb-imr .California). Los pares de cebadores 515F/926R y 956F/1401R dirigidos a las regiones V4-V5 y V6-V8 se utilizaron para amplificar los genes de ARNr 16S bacterianos y arqueales, respectivamente78,79. Los amplicones se secuenciaron utilizando el sistema Illumina MiSeq de extremos emparejados (2 × 300 pb) (Illumina, EE. UU.) en Integrated Microbiome Resource (IMR), Universidad de Dalhousie, Canadá (//cgeb-imr.ca). Las muestras que no fueron amplificadas fueron excluidas de análisis adicionales. Las secuencias del adaptador y del cebador se eliminaron utilizando Cutadapt versión 2.1080 y las secuencias resultantes se procesaron utilizando DADA2 versión 0.9.581 para inferir variantes de secuencia de amplicones (ASV). Para el proceso de recorte de calidad, aplicamos una opción de filtrado de maxN = 0, maxEE = c (2,2) y truncQ = 2. Las colas de baja calidad de ambas lecturas se eliminaron con truncLen = c (270,210). La eliminación de ruido se realizó después del recorte según el modelo de error DADA2. Se eliminaron las secuencias y se aplicó el algoritmo de inferencia de la muestra central a los datos eliminados. Se fusionaron lecturas emparejadas y se eliminaron las secuencias quiméricas. Los siguientes procesos se realizaron después de construir una tabla de secuencia de ASV para asignar taxonomía utilizando el software mothur82. Las asignaciones taxonómicas de secuencias representativas de ASV se determinaron en comparación con la base de datos EzBiocloud mediante búsquedas de similitud de secuencias83. Después de la asignación taxonómica, las arqueas y los ASV desconocidos se eliminaron para el análisis bacteriano, y las bacterias y los ASV desconocidos se eliminaron para el análisis de arqueas. Todos los datos de secuencia utilizados en este estudio se depositaron en el Archivo de lectura de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica con el número de acceso PRJNA825649. Los árboles filogenéticos de los principales ASV arqueales de Metanomicrobia con abundancias relativas superiores al 3% se construyeron utilizando el algoritmo de máxima verosimilitud84 con el modelo evolutivo reversible en el tiempo general utilizando MEGA X85. La solidez de las topologías de los árboles se evaluó mediante análisis bootstrap basados en 1000 replicaciones de las secuencias.

Para proporcionar una visión general de la variabilidad de la abundancia de oligoelementos y las distribuciones de lípidos microbianos en las muestras de carbonato, primero se llenaron los vacíos en el conjunto de datos como se describió anteriormente86. Cuando algunos componentes no fueron determinados, se estableció como límite de detección un valor de la mitad del valor mínimo detectado para esa variable en todo el conjunto de datos. Luego, estos valores fueron reemplazados por un número aleatorio entre cero y el límite de detección. Finalmente, las abundancias fraccionarias de oligoelementos y lípidos microbianos se obtuvieron normalizando cada concentración a las concentraciones sumadas de todos los oligoelementos y lípidos microbianos, respectivamente. Según las abundancias fraccionarias, la PCA se realizó utilizando el software R versión 3.4.2 (información del paquete; FactoMineR, Viena, Austria).

Todos los datos de secuencia de ADN generados para este estudio se depositaron en el Archivo de lectura de secuencias del Centro Nacional de Información Biotecnológica con el número de acceso PRJNA825649.

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Nos gustaría agradecer al capitán y a la tripulación del B/V ARAON su ayuda en el mar. Este estudio fue apoyado por el Instituto Coreano de Promoción de Ciencias y Tecnología Marinas (KIMST) (Beca KIMST 20210632; KOPRI-PM22050) y una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el Ministerio de Ciencia y TIC (NRF-2021M1A5A1075512; KOPRI-PN22013).

Dong Hun Lee

Dirección actual: División de Investigación del Medio Marino, Instituto Nacional de Ciencias Pesqueras, Busan (República de Corea)

Departamento de Ciencias Marinas y Tecnología Convergente, Campus ERICA de la Universidad de Hanyang, Ansan, 15588, República de Corea

Dong Hun Lee y Kyung Hoon Shin

Instituto de Investigaciones Polares de Corea, Incheon, 21990, República de Corea

Jung Hyun Kim, Yung Mi Lee, Dahae Kim, Young Jin Joe y Young Keun Jin

CNRS, Ifremer, Universidad de Brest, Geo-Ocean, 29280, Plouzané, Francia

Germán Bayón

Centro de Investigación de Ingeniería de Ciencia y Tecnología Hadal de Shanghai, Facultad de Ciencias Marinas, Universidad Oceánica de Shanghai, Shanghai, 201306, China

Xu Dong Wang

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DHL y JHK diseñaron y coordinaron el estudio. DHL, JHK, YML, YJJ y YKJ realizaron el trabajo de campo durante la expedición ARAON. GB y XW realizaron el análisis de oligoelementos. DHL y DK llevaron a cabo el análisis de biomarcadores lipídicos. YML realizó el análisis de ácido nucleico. DHL y JHK lideraron la redacción e interpretación de los datos. Todos los autores comentaron el manuscrito y contribuyeron a la redacción.

Correspondencia a Jung-Hyun Kim.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Lee, DH., Kim, JH., Lee, YM et al. Firmas de metaloenzimas en carbonatos autigénicos de las zonas fronterizas de Chukchi en el Océano Ártico occidental. Informe científico 12, 16597 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-21184-6

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Recibido: 29 de marzo de 2022

Aceptado: 23 de septiembre de 2022

Publicado: 05 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-21184-6

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